 | Josh Keaton als Peter Parker/Spider-Man (voice) |
 | Lacey Chabert als Gwen Stacy (voice) |
 | James Arnold Taylor als Harry Osborn (voice) |
 | Alan Rachins als Norman Osborn (voice) |
 | Deborah Strang als Aunt May Parker (voice) |
 | Ben Diskin als Eddie Brock (voice) |
 | Dee Bradley Baker als Curt Connors/Lizard (voice) |
 | Robert Englund als Adrian Toomes/Vulture (voice) |
 | Crispin Freeman als Max Dillon/Electro (voice) |
 | Jeff Bennett als Montana/Shocker (voice) |
 | Daran Norris als J. Jonah Jameson (voice) |
 | Joshua LeBar als Flash Thompson (voice) |
 | Peter MacNicol als Otto Octavius/Doctor Octopus (voice) |
 | Alanna Ubach als Liz Allen (voice) |
 | Grey DeLisle als Sally Avril (voice), Betty Brant (voice) |
 | Clancy Brown als Alex O'Hirn/Rhino (voice) |
| José Zelaya | Character Designer |
| Greg Weisman | Writer |
| Troy Adomitis | Director |
| Dave Bullock | Director |
| Stan Lee | Executive Producer |
| Greg Weisman | Producer |
| Kevin Hopps | Writer |
| Victor Cook | Director |
